facebook twitter instagram issuu linkedin google+ research gate youtube ustv

Nauka na wyciągnięcie ręki

Obszar nauk humanistycznych
Obszar nauk społecznych
Obszar nauk ścisłych
Obszar nauk przyrodniczych
Obszar nauk technicznych
Obszar sztuki

Inicjowanie i rozwój wierzchołka korzenia bocznego u dzikiego typu Arabidopsis thaliana i u modyfikowanych genetycznie form

Założenia projektu badawczego realizowanego przez dr Joannę Szymanowską - Pułkę z Zakładu Biofizyki i Morfogenezy Roślin Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego.

Projekt badawczy własny nr N N303 333936 pt. Inicjowanie i rozwój wierzchołka korzenia bocznego u dzikiego typu Arabidopsis thaliana i u modyfikowanych genetycznie form - badania eksperymentalne i modelowanie komputerowe jest finansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego.

Funkcjonowanie systemów korzeniowych i ich regulacja u różnych gatunków roślin jest zagadnieniem szeroko podejmowanym w badaniach naukowych. System korzeniowy pełni wiele funkcji w roślinie: utrzymuje ją w podłożu, dostarcza wodę i składniki odżywcze, a przez jego tkanki transportowane są hormony wzrostowe, które korzeń wymienia z pędem. Szczególnym obiektem zainteresowań są rośliny użytkowe, ale także Arabidopsis thaliana, która okazała się rośliną modelową do badań rozwoju korzenia. Badacze tego zagadnienia zostali stosunkowo niedawno wyposażeni w potężne narzędzie jakim są metody biologii molekularnej, które umożliwiają obserwacje ekspresji genów regulujących funkcje korzenia poprzez ich fuzje z genami reporterowymi kodujacymi na przykład białko GFP (Green Fluorescent Protein), czy bakteryjny enzym b-glukuronidazę (GUS).

Metody te znalazły zastosowanie w badaniach nad rozwojem korzenia bocznego, procesem interesującym i nie do końca zbadanym. Inicjowanie tego organu to de facto formowanie nowego merystemu w obszarze dojrzałych wyróżnicowanych komórek perycyklu.
Podczas badania wzrostu korzeni bocznych możliwe jest śledzenie wszystkich etapów rozwoju nowego organu od momentu jego inicjowania poprzez pierwsze podziały komórek perycyklu korzenia macierzystego do osiągnięcia formy dojrzałej. Proces ten, w przeciwieństwie do rozwoju innych organów roślinnych, jest stosunkowo łatwy do obserwacji. Zastosowanie w badaniach różnych form transgenicznych Arabidopsis może poszerzyć aktualną wiedzę o przebiegu tego procesu.

Rys. 1

Rys. 1. Korzeń boczny formujący się u Arabidopsis thaliana, linia DR5::GFP. Widoczna autofluorescencja wiązek przewodzących korzenia macierzystego i ekspresja białka reporterowego w korzeniu bocznym (strzałka) (Szymanowska-Pułka, niepublikowane).

Planowane badania obejmują dwa etapy: eksperymentalny i modelowy. Celem części eksperymentalnej badań jest szczegółowa analiza rozwoju korzeni bocznych u dzikiego typu i wybranych linii transgenicznych Arabidopsis, których konstrukty zawierają geny kodujące białka odpowiedzi na auksynę: DR5::GUS, DR5::GFP oraz białka - przenośniki wpływu i wypływu auksyny do i z komórki, odpowiednio: pAUX1::AUX1:YFP i pPIN1::PIN1:YFP, a następnie porównanie przebiegu tego procesu u różnych form. Materiał empiryczny otrzymany w tym etapie badań stanie się podstawą dla badań modelowych.

Część modelowa badań ma na celu opracowanie modelu wzrostu i podziałów komórek dla wierzchołka korzenia bocznego Arabidopsis. Model powstanie w oparciu o metodę tensora wzrostu i związanych z nim głównych kierunków wzrostu, wyznaczających płaszczyzny podziałów komórek organu. Wynikiem zastosowania modelu będą sekwencje pokazujące kolejne etapy rozwoju wierzchołka korzenia bocznego z uwzglednieniem zmian zachodzących w jego wielkości, kształcie i organizacji komórkowej. W celu weryfikacji modelu jego wynik zostanie porównany z rzeczywistymi układami komórek pochodzącymi z eksperymentu. Uzyskane wyniki mogą dostarczyć nowych informacji o rozwoju korzeni bocznych u Arabidopsis, a model może stać się cennym narzędziem w badaniach porównawczych i rozwojowych korzeni.

Zagadnienie formowania korzeni bocznych było już podejmowane: analiza i symulacje komputerowe tego procesu u rzodkiewki (Raphanus sativus) były tematem rozprawy doktorskiej (Szymanowska-Pułka 2007). W badaniach tych hodowano siewki rzodkiewki, w których obserwowano rozwój korzeni bocznych na różnych etapach. Następnie prowadzone były symulacje tego procesu z zastosowaniem metody tensora wzrostu opracowanej przez Hejnowicza i Rombergera (1984) i zaadaptowanej do opisu wzrostu organów roślinnych przez zespół Jerzego Nakielskiego.

 

Rys. 2

Rys. 2. Przykład zastosowania tensorowego modelu wzrostu i podziałów komórek do opisu rozwoju korzenia bocznego u rzodkiewki. Na fotografię korzenia pochodzącą z badań anatomicznych nałożono układ komórek otrzymanych z symulacji komputerowych (Szymanowska-Pułka, niepublikowane).

 

Tensor wzrostu (Hejnowicz i Romberger 1984) jest znakomitym narzędziem umożliwiającym opis wzrostu organów roślinnych z uwzględnieniem podziałów komórek (Nakielski 1999, 2000, 2008). Jego zastosowanie do badań modelowych wymaga zdefiniowania pola szybkości wzrostu i precyzyjnego dopasowania parametrów tego pola do przypadku konkretnego organu oraz opracowanie algorytmu na podziały komórek. Na ich podstawie formułuje się model, w oparciu o który prowadzone są symulacje komputerowe. Efektem symulacji są sekwencje pokazujące rozwój układu komórek w czasie (Nakielski 2008). W celu zastosowania tej metody do opisu wzrostu korzenia bocznego konieczne jest zdefiniowanie takiego pola szybkości wzrostu, które pozwoli na uwzględnienie zmian morfologicznych i anatomicznych organu.

Model umożliwia ciągłe śledzenie zmian zachodzących w układzie komórek wierzchołka podczas jego rozwoju, od momentu jego inicjowania w perycyklu korzenia macierzystego do uzyskania dojrzałej formy. Otrzymane na jego podstawie sekwencje rozwoju korzenia bocznego Arabidopsis mogą stanowić dla botaników oryginalne i praktyczne narzędzie, które znajdzie zastosowanie w badaniach rozwojowych i porównaczych.

Projekt jest konsekwencją zainteresowań naukowych kierownika, ale jest także kontynuacją badań rozpoczętych w ramach 2007-2008 Fulbright Senior Research Grant w laboratorium prof. Lewisa Feldmana w Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley. Prowadzone tam prace dotyczyły między innymi hodowli form transgenicznych Arabidopsis i obserwacji u tych form rozwoju korzeni bocznych. Przeniesienie badań na grunt polski pozwoli poszerzyć zakres problematyki badawczej Zakładu Biofizyki i Morfogenezy Roślin oraz wprowadzić nowe metody badawcze, przyczyniając się tym samym do rozwoju naukowego zespołu.

W planowanych badaniach konieczne jest zastosowanie nowoczesnych technik biologii molekularnej oraz mikroskopii optycznej (kontrastowo-fazowa, fluorescencyjna, konfokalna).

METODYKA BADAŃ

Etap 1

Obiektem planowanych badań jest Arabidopsis - roślina niewielkich rozmiarów i łatwa w hodowli, co zdecydowało, że obecnie pełni rolę rośliny modelowej w badaniach laboratoryjnych. Jej wierzchołek korzenia ma małą liczbę komórek, dzięki czemu znakomicie nadaje się zarówno do eksperymentów, jak i do modelowania komputerowego.

Materiał: Badania prowadzone na siewkach dzikiego typu Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., ekotyp Columbia (Col-0) (nasiona zakupione w European Arabidopsis Stock Centre NASC) oraz na formach transgenicznych Arabidopsis thaliana zawierających konstrukty DR5::GUS, DR5::GFP, pPIN1::PIN1:GFP (nasiona zostaną udostępnione dzięki uprzejmości Lewisa Feldmana, UC Berkeley) i pAUX1::AUX1:YFP (dzięki uprzejmości Hugo Hufhuisa, Department of Molecular Genetics, Utrecht University).

Rys. 3

Rys. 3. Korzeń boczny formujący się u dzikiego typu Arabidopsis thaliana. Wyraźnie widoczny układ komórek otrzymany dzięki technice rozjaśniania preparatów (Szymanowska- Pułka, niepublikowane).

 

Metody: Hodowla siewek z nasion będzie prowadzona z zachowaniem warunków sterylnych na agarze z pożywką MS (Murashige i Skoog). Szalki z siewkami zostaną umieszczone w pokoju hodowlanym o temperaturze 22-23oC w pozycji zapewniającej pionową orientację roślin. Po 10-14 dniach hodowli, siewki zostaną utrwalone i rozjaśnione wodzianem chloralu. Jak wykazały wstępne analizy, takie przygotowanie materiału pozwala na obserwację układu ścian komórkowych wierzchołków korzeni w mikroskopie świetlnym z zastosowaniem kontrastu fazowego. Siewki z konstruktem DR5::GUS będą poddawane procedurze histochemicznego barwienia na aktywność GUS. W przypadku siewek, które wykazują ekspresję białek GFP i YFP, obserwacje prowadzone będą z zastosowaniem światła UV oraz mikroskopu konfokalnego. Część materiału empirycznego zostanie dostarczona przez prof. Lewisa Feldmana w ramach kontynuacji współpracy kierownika projektu z zespołem z UC Berkeley. Dokumentacja fotograficzna badanego materiału posłuży do analizy układów komórek rozwijających się korzeni bocznych.

Sprzęt i aparatura: Pokój hodowlany z kontrolowaną temperaturą i fotoperiodem, komory z laminarnym przepływem powietrza do pracy w warunkach sterylnych, autoklawy, lada do hodowli roślin, pH-metr, mikroskop konfokalny, mikroskop świetlny z możliwością wykorzystania technik fluorescencyjnej i kontrastowo-fazowej, cyfrowy aparat fotograficzny współpracujący z mikroskopem świetlnym. Wszystkie prace związane z użyciem roślin modyfikowanych genetycznie będą prowadzone w pomieszczeniach Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska przeznaczonych do tych celów i odpowiednio oznakowanych.

Etap 2

Do symulacji rozwoju wierzchołka korzenia bocznego u Arabidopsis thaliana zostanie zastosowany tensorowy model wzrostu i podziałów komórek (Nakielski 2000, 2008). Elementami modelu są: pole TW zdefiniowane dla badanego organu, algorytm na podziały komórek oraz wejściowy układ komórek. Pole TW oraz reguły na podziały komórek definiuje się w oparciu o dane empiryczne, z których wnioskuje się o sposobie wzrostu i rozwoju organu. Układ komórek, który stanowi dane wejściowe dla modelu, otrzymuje się przez digitalizację układu ścian komórkowych organu, który w modelu reprezentowany jest przez siatkę wielokątów. Zasada działania modelu jest następująca: siatka wielokątów, opisująca układ komórek, poddawana jest działaniu pola TW. Wskutek wzrostu ulega deformacji, a oczka siatki reprezentujące komórki powiększają się. Kiedy oczko przekroczy rozmiary przyjęte za krytyczne, komórka dzieli się, wewnątrz oczka pojawia się nowa ściana dzieląca je na dwie cześci. Każda z tych części od tej pory reprezentuje komórkę potomną. Po wstawieniu nowej ściany, siatka ulega modyfikacji i organ rośnie dalej. Zapisując siatkę w zadanych czasach otrzymuje się sekwencję pokazującą, jak układ komórek rozwija się w czasie (Nakielski 2000, 2008).

Zaadaptowanie modelu dla przypadku korzenia bocznego Arabidopsis będzie wymagało:

  • digitalizacji układu komórek perycyklu korzenia macierzystego; układ ten będzie stanowił wejściowe dane dla modelu,
  • zdefiniowania pola prędkości przesunieć punktów w rozwijającym się wierzchołku z uwzględnieniem zależności parametrów pola od czasu,
  • określenia i przeanalizowania pola TW pod względem przestrzennej i kierunkowej zmienności,
  • sformułowania reguł na podziały komórek.

Symulację wzrostu prowadzić będzie program komputerowy. Efektem symulacji będą sekwencje pokazujące wzrost i rozwój wierzchołka korzenia bocznego w kolejnych krokach czasowych. Złożenie sekwencji w innym, specjalnie przygotowanym programie, pozwoli na wizualizację modelowanego procesu wzrostu w postaci animacji. Weryfikacja modelu zostanie przeprowadzona przez porównanie wyniku symulacji z rzeczywistymi układami komórek.

Zespół badawczy

Zespół stanowią pracownicy Zakładu Biofizyki i Morfogenezy Roślin oraz Zakładu Biologii Komórki. W zespole jest biolog i troje biofizyków - przedstawiciele dwóch dyscyplin naukowych adekwatnie do tematyki planowanego projektu. Wszyscy członkowie zespołu posiadają znaczne doświadczenie w pracy laboratoryjnej. W zespole są dwie osoby dobrze przygotowane do prac z zastosowaniem metod histochemicznych: dr Joanna Szymanowska-Pułka (badania rozwoju korzeni u modyfikowanych genetycznie linii Arabidopsis w ramach 2007-2008 Fulbright Senior Research Grant w UC Berkeley) i dr Izabela Potocka (badania z wykorzystaniem metod immunocytochemicznych - staż w School of Applied Sciences, University of Wolverhampton). Dr Izabela Potocka jest specjalistką w stosowaniu technik mikroskopowych. Biofizycy: dr hab. Jerzy Nakielski, dr Joanna Szymanowska-Pułka oraz mgr Jerzy Karczewski od wielu lat zajmują się modelowaniem komputerowym wzrostu organów roślinnych metodą tensora wzrostu. Dr hab. Jerzy Nakielski jest autorem modelu wzrostu i podziałów komórek w wierzchołku pędu i korzenia (1999, 2000, 2008).

LITERATURA

HEJNOWICZ Z., ROMBEREGER J.A., 1984. Growth tensor of plant organs. J. theor. Biol. 110, 93-114.
NAKIELSKI J., 2000. Tensorowy model wzrostu w zastosowaniu do wierzchołka korzenia. Wyd. U. Śl., Katowice.
NAKIELSKI J., 2008. The tensor-based model for growth and cell divisions of the root apex. I. The significance of principal directions. Planta, 228, 179-189.
SZYMANOWSKA-PUŁKA J., 2007. Application of a changing field of growth rates to a description of root apex formation. J. Theor. Biol. 247/4, 650-656.


Skróty

Biuletyn Informacji Publicznej
Copyright © 2001-2018
Uniwersytet Śląski w Katowicach
Wszelkie prawa zastrzeżone.